熒光-PCR法的主要理論依據說明

更新時間：2021-04-08

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　　熒光-PCR法是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應過程。PCR擴增時加入一對引物和一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，淬滅基團抑制報告基團的熒光發(fā)射。剛開始時，探針結合在DNA任意一條單鏈上，PCR擴增時，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，報告基團與淬滅基團發(fā)生分離，抑制作用被解除，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。隨著PCR反應的進行，反應產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環(huán)，收集一次熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化，結合相應的軟件對產物進行分析進而得到一條熒光擴增曲線。熒光擴增曲線分熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平臺期三個階段。指數期的PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，因此我們選擇在這個階段進行定量分析，計算出待測樣品初始模版的量。

　　熒光-PCR法的理論依據是什么？

　　特定的待擴增基因片段起始含量越大，則指數擴增過程越短，當擴增速率趨于穩(wěn)定后，則無論原來樣品中起始模板含量多少，終擴增片段的含量通常是一樣的。理想的擴增結果：Y=X×2n；其中：Y代表擴增產物量，X代表PCR反應體中的原始模板數，n為擴增次數；理論上PCR擴增效率為100，PCR產物隨著循環(huán)的進行成指數增長，但實際上DNA的每一次復制都不*，即每一次擴增中，模板不是呈2的倍增長；實際應為：Y=X(1+E)n，其中：E代表擴增效率，E=參與復制的模板/總模板，通常E≤1，E在整個PCR擴增過程中不是固定不變的。通常X在1-105拷貝、循環(huán)次數n≤30時，E相對穩(wěn)定，原始模板以相對固定的指數形式增加，適合定量分析，這也就是所謂的指數期；隨著循環(huán)次數n的增加（＞30次），E值逐漸減少，Y呈非固定的指數形式增加，后進入平臺期。