大鼠ELISA試劑盒試驗老是失敗的幾個因素

更新時間：2022-11-14

點擊次數：692

　　大鼠ELISA試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗體包被于酶標板上，實驗時樣品或標準品中的抗原會與包被抗體結合，游離的成分被洗去。依次加入生物s化物的抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素。抗體與結合在包被抗體上的抗原結合、生物s與親和素特異性結合而形成免疫復合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現藍色，加終止液后變成黃色。用酶標儀在450nm波長處測OD值，抗原濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣品中指標的濃度。

　　大鼠ELISA試劑盒試驗時老是失敗的幾個因素分析：

　　一、低信號強度

　　如果ELISA讀數低于吸光度下限，且目標樣本濃度超出標準曲線范圍，則進行分析的樣本濃度可能太低，或者儀器所能分析的樣本檢測最佳條件可能未被滿足。在這種情況下，樣本所產生的檢測信號應該需要被級聯放大。

　　解決方案：

　　1.增加抗體的孵育時間。如果在室溫下孵育您的抗體2小時后的實驗結果并不理想，那么可以嘗試在4℃孵育過夜。如此，可允許抗原抗體大程度上的結合，并能擴大ELISA中的反應信號。

　　2.增加二抗-酶結合物的濃度。ELISA中的E代表酶（通常是辣根過氧化物酶，HRP），它與底物（通常是TMB）反應后可產生鮮艷的藍色。因而，將HRP濃度提高50％或將其加倍，則會產生更強的顏色，易于檢測。

　　3.充分避光，以保護TMB基質不受光照影響，并確保其能最大限度地發揮其性能。考慮到TMB對光線非常敏感，因而在黑暗中進行ELISA平板的顯色反應會產生更強的信號。

　　二、重復性不好

　　同一個樣本間的各個復孔的讀數有顯著性差異。

　　解決方案：

　　1.加樣量多少不一，操作時間長短不一。重復同一樣本時，加樣量與加樣時間理應相同，同時也應注意移液器的校準。加樣后可輕微晃動酶標板使反應液充分混合。

　　2.樣本應保證一致、無污染，并應該由同一名操作人員進行操作。

　　3.精密度測定方法不標準，此時理應采用正確的方法進行操作。