腦膜炎奈瑟菌PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
DL-Serine人前脂肪細(xì)胞*培養(yǎng)基4-乙基苯甲 ≥97%

N-Acetyl-DL-Serine人腦動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞*培養(yǎng)基六氟乙酰酮 98%

D-Cycoloserine人腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞*培養(yǎng)基3,4,5-三氟苯酸 97%

L-Seril人腦靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞*培養(yǎng)基3,4,5-三氟苯酚 98%

NAC人腦靜脈血管平滑肌細(xì)胞*培養(yǎng)基2-(2-溴乙基)-1,3-二惡烷 98%

ATEE人腦膜細(xì)胞*培養(yǎng)基2-羥甲基-3,4-二氫吡喃 97%

N-Acetyl-DL-Alanine人神經(jīng)元細(xì)胞*培養(yǎng)基對(duì)羥基苯甲酸丁酯 99%

NAN人神經(jīng)少突起前質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞*培養(yǎng)基尼泊金乙酯 AR,99%

L-Tyrosine ethyl ester hydrochloride人神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞*培養(yǎng)基乙二苯 98%

L-Pyroglutamic acid人神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞*培養(yǎng)基6-羥基-2-萘甲酸 98%

DL-Pyroglutamic acid人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞*培養(yǎng)基對(duì)羥基苯甲酸 99%

CBZ-L-Pyroglutamic acid人腦成纖維細(xì)胞*培養(yǎng)基對(duì)羥基苯甲酸 ≥99%

Phosphoramidon disodium salt人小腦顆粒細(xì)胞*培養(yǎng)基4-羥基苯甲酸異丁酯 99%

Glycyl-L-glutamine人晶狀體上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基4-羥基苯甲酸異酯 99%

Alu-Gln人角膜上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉 99%

Gly-Leu人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉 Ph Eur

去氨加壓素;去氨壓素SCN9A/NAV1.7(Sodium channel protein type 9 subunit alpha)  電壓開(kāi)啟的鈉離子通道SCN9A抗原TBX-5  轉(zhuǎn)錄因子Tbx5抗體

莫匹羅星,假單胞菌酸CXCL14(CXC-chemokine ligand 16)  CXC趨化因子14抗原TBX3  轉(zhuǎn)錄因子Tbx3抗體

匹伐他汀叔丁酯CXCL16 peptide  CXC趨化因子16抗原Tbx21/T-bet  T細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Tbx21抗體

己烯雌酚()Sema3A (semaphorin 3A)  臂板蛋白3A(多肽)TBX2/T-box2  血栓素B2抗體(一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因)

己烯雌酚()（標(biāo)準(zhǔn)品）Sema3F (semaphorin 3F)  臂板蛋白3F抗原TBX2/T-box2  新型抑癌基因抗體

多烯紫杉無(wú)/多西他賽SFRP1(Secreted frizzled related protein 1)  分泌型卷曲相關(guān)蛋白1抗原TBX18  轉(zhuǎn)錄因子Tbx18抗體

多烯紫杉無(wú)/多西他賽（標(biāo)準(zhǔn)品）SGLT1(sodium-glucose cotransporter1)  鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體1抗原TBX1/Brachyury  先心病相關(guān)蛋白TBX1抗體

多烯紫杉三合物Shadow/SPRN(Shadow of prion protein precursor)  新朊蛋白/朊蛋白相關(guān)蛋白/沙杜（Shadoo）蛋白抗原TBRG4  轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β調(diào)節(jié)蛋白4抗體

多烯紫杉三(標(biāo)準(zhǔn)品)Shiga-like toxin IIe variant subunit A 0139[Escherichia coli 0139]  大腸桿菌志賀樣毒素Ⅱ型突變體（O139菌型）TBRG1  轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β調(diào)節(jié)蛋白1抗體

鹽酸多奈哌齊III型Shiga-like toxin IIe variant subunit A[Escherichia coli 0139]  大腸桿菌志賀樣毒素菌體蛋白（O139菌型）TBLR1/TBL1XR1  轉(zhuǎn)導(dǎo)素β1X連鎖受體蛋白1抗體
腦膜炎奈瑟菌PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)人層連蛋白/板層素(LN)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：2～8℃5克

人腸病毒(Enterovirus)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：100克

人腸三葉因子(ITF)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：100毫升

人腸脂肪酸結(jié)合蛋白(iFABP)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：100克

人超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：100克

人超敏前列腺特異性抗原(PSA-US)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：

人超敏生長(zhǎng)激素(US-GH)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT5米

人超敏游離雌三醇(uE3)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT1米
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。