注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
Gum benzoin二酸 AR,99.5%磷鎢酸 AR

Borneol二酸 CP,98%1,1,1,2-四氟乙烷 99.95%

Abietic acid二酸 分析標(biāo)準(zhǔn)品碳酸烯酯 99%

Cyanuric chloride疊氮磷酸二苯酯  97% 碳酸烯酯 CP

2-VP疊氮基*基硅烷 93%碳酸烯酯 for HPLC, 99.7%

1,1,2-Trichlorotrifluoroethane3-溴酸 98%碳酸烯酯 99.7%,無(wú)級(jí)

Ethyl ferulate異酸氯磺酰酯 98%對(duì)甲氧基苯胺 97.0%

Soybean oil三聚氯 99%對(duì)甲氧基苯胺 AR，99.0%

Pentetrazol1,3-二氨基胍鹽酸鹽 97%對(duì)甲 98%

Ellagic acid基氫鈉 95%對(duì)氨基酚 CP，98%

PVF二胺鈉 96%對(duì)氨基酚 99% (HPLC)

Uric acid基氫鈉 1.0 M in THF間氯 CP,98%

Pyrene基氫鈉 5.0 M in 1 M NaOH間氯 GR，99%

3-Methyl-1,2-cyclopentanedione硫酸亞鐵，七 AR鄰氯 GR,99%

Propylthiouracil硫酸亞鐵，七 99.99% metals basis鄰氯 GCS，>99.5% (GC)

Tangeretin硫酸鎂，七 AR,99.0%鄰氯 CP,98%

舒緩激肽三醋酸鹽Citrate Synthase (D7V8B) Rabbit mAbPKMYT1  髓鞘轉(zhuǎn)錄因子1激酶抗體

α-促黑激素,黑素皮質(zhì)素Phospho-GSK-3β (Ser9) (D85E12) XP® Rabbit mAb (Pacific Blue^™ Conjugate)PKC-γ/SCA14  蛋白激酶C亞型G抗體

內(nèi)皮素-1，人，豬E4BP4/NFIL3 (D5K8O) Rabbit mAbPKC epsilon  蛋白激酶C抗體

蛙皮素,胃泌素C-Reactive Protein (D1N1U) Rabbit mAbPKC delta  蛋白激酶C亞性D型抗體

血管活性腸肽NAE1/APPBP1 (D9I4Z) Rabbit mAbPKC beta 1/2  蛋白激酶C beta 1/2抗體

焦碳酸二乙酯Spi-B (D3C5E) Rabbit mAbPKC alpha  蛋白激酶C α抗體

DEPC;焦碳酸二乙酯(sigma)NFAT1 (D43B1) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)PKB/AKT-1  蛋白激酶B

瓊脂糖(Biowest,電泳級(jí));西班牙瓊脂糖TRIM5α (D6Z8L) Rabbit mAbPKA/PKAcat/PKACB  蛋白激酶A抗體

烯酰胺(超純)GCKR (D1W9P) Rabbit mAbPKA regulatory subunit I beta  蛋白激酶受體相關(guān)1β抗體

聚乙二400Phospho-GSK-3β (Ser9) (D85E12) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)PKA R2/PKA IIα  蛋白激酶A受體2α亞基抗體
白堊立克次氏體PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)兔抗腦組織抗體(ABAb)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT1克

兔抗平滑肌抗體(ASMA)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：25克

兔抗糖蛋白抗體(GP)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：2～8℃5克

兔可溶性凋亡相關(guān)因子(sFAS/Apo-1)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：100克

兔粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：2～8℃1克

兔淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原3(LFA-3/CD58)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：25克

兔內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eS)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：2～8℃250毫克

兔尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：2～8℃1克
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。