鏈霉菌通用PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
9,17-Octadecadiene-12,14-diyne-1,11,16-triol1,2-二氯乙烷  for HPLC, ≥99.9%氣相納米二氧化硅 99.8%,比表面積（BET）：380m2/g;粒徑：7-40nm

Annacin1,2-二氯乙烷標(biāo)準(zhǔn)熔液 1.20mg/ml，基體：甲疏性氣相納米二氧化硅 99.8%,比表面積（BET）：115m2/g；粒徑

Decanedioic acid1,2-二氯乙烷 for spectroscopy，≥99.8%（GC)氣相納米二氧化硅 99.8%,比表面積（BET）：150m2/g；粒徑：7-40n

Falcarindiol1,2-二氯乙烷 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥99.9% (GC)二氧化硅 99.9% metals basis

Falcaril乙基苯 AR,98.5% 二氧化硅 AR

Ginseyne K乙基苯 >99.5%(GC)甲基烯酸二乙基氨基乙酯, 包含100 ppm 吩噻, 99%

Glycerol 1-(26-hydroxyhexacosaate)草酸 CP，99.5%烯酸二甲基氨基乙酯 99%

(R,E)-Deca-2-ene-4,6-diyne-1,8-diol草酸 GR，99.8%甲基烯酸二甲氨乙酯 99%

(S,E)-Deca-2,9-diene-4,6-diyne-1,8-diol2-氯煙酸 98%甲基烯酸異辛酯 99%

(Z)-Lachphyllum lactone1,10-癸二 98%甲基烯酰氧乙基*基氯化銨 75 wt. % in H2O

1,2-Benzenedicarboxylic acid十二烷二酸 99%鋯粉 99.95% metals basis ((不包括鉿))

1-2-Cyclohexanedione1,2-十六烷二 95%鋯粉 99.5% metals basis ((不包括鉿)),200 目

1,5-Anhydro-D-glucitol1,8-辛二 98%偶氮二異戊 98%

1,6-Dioxaspiro[4.5]decan-2-methal1,2-十四碳二 90%2,4-二羥基二苯甲酮 99%

1-Chloroindan十四烷二酸 98%2-羥基-4-甲氧基-5-磺酸二苯甲酮 98%

1-Deoxyjirimycin碳酸二乙酯 99%2-羥基-4-正辛氧基二苯甲酮 99%

溴百里香酚藍(lán)Phospho-Estrogen Receptor α (Ser118) (16J4) Mouse mAbphospho-c-Abl(Tyr412)  磷酸化非受體酪氨酸激酶c-Abl抗體

溴甲酚紫p190-A RhoGAP Antibodyphospho-c-Abl(Tyr283)  磷酸化非受體酪氨酸激酶c-Abl抗體

溴甲酚紫(98%)MTHFR (D1E4V) Rabbit mAbphospho-c-Abl(Tyr276)  磷酸化非受體酪氨酸激酶c-Abl抗體

鉍試劑Ⅱ(CP)REDD1 Antibodyphospho-c-Abl(Tyr272)  磷酸化非受體酪氨酸激酶c-Abl抗體

鉍試劑Ⅱ(98%)TGF-β Receptor III Antibodyphospho-c-Abl(Tyr251)  磷酸化非受體酪氨酸激酶c-Abl抗體

鈹試劑ⅡSUFU (C54G2) Rabbit mAbphospho-c-Abl(Tyr245)  磷酸化非受體酪氨酸激酶c-Abl抗體

溴鄰苯三酚紅SUFU (C54G2) Rabbit mAbphospho-c-Abl(Tyr204)  磷酸化非受體酪氨酸激酶c-Abl抗體

溴甲酚綠鈉Phospho-p53 (Ser46) Antibodyphospho-c-Abl(Tyr134)  磷酸化非受體酪氨酸激酶c-Abl抗體

鹽酸副品紅Phospho-p53 (Ser46) Antibodyphospho-c-Abl(Thr754)  磷酸化非受體酪氨酸激酶c-Abl抗體

二苯胺磺酸鋇(CP)CD4 (D7D2Z) Rabbit mAbphospho-c-Abl(Ser735)  磷酸化非受體酪氨酸激酶c-Abl抗體
鏈霉菌通用PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書2-Fluorobiphenyl,96%通用試劑　5G

3,5-Dichloroiodobenzene,99%通用試劑　5G

3-Bromoiodobenzene,98%通用試劑　5G

Anti-Human IgM，Purified antibody prod...純抗體　5MG

2-Bromoiodobenzene,99%通用試劑　1G

4-Iodotoluene,99%通用試劑　25G

2-Iodotoluene,98%通用試劑　25G

3-Bromonitrobenzene,97%通用試劑　25G

2,5-Dimethylbromobenzene,99%通用試劑　25G

1,2-Dibromobenzene,98%通用試劑　5G

2-Bromo-5-methoxytoluene,98%通用試劑　5ML

2,4-Dichloro-1-fluorobenzene,99%通用試劑　5G

3,5-Di-tert-butylbromobenzene,97%通用試劑　1G

1-Bromo-4-fluorobenzene,99%通用試劑　25G

1,4-Diethynylbenzene,96%通用試劑　1G
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。